SPA-L3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411666-ACT

Il gene umano **SIPA1L3** codifica **SPA-L3**, una proteina scaffold di segnalazione multidominio che interagisce con reti regolatorie delle piccole GTPasi e organizza complessi proteici alla membrana plasmatica e nel citoscheletro corticale. Grazie alla sua associazione con componenti delle vie Rap/Ras e con complessi collegati all’actina, SPA-L3 è in grado di influenzare la polarità cellulare, l’adesione e il rimodellamento dinamico del citoscheletro che guidano migrazione e morfogenesi. Un’alterata regolazione di questi processi è frequentemente implicata in comportamenti invasivi e in un’architettura tissutale aberrante, rendendo **SIPA1L3** un locus utile per studiare la riorganizzazione delle vie di segnalazione in stati cellulari rilevanti per la malattia. L’espressione di **SIPA1L3** e la connettività della sua rete risultano quindi informative in modelli che analizzano la segnalazione prossima alla membrana, il controllo del citoscheletro e la plasticità fenotipica.

SPA-L3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SIPA1L3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SPA-L3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SIPA1L3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SIPA1L3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SPA-L3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SIPA1L3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SPA-L3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SPA-L3 nelle cellule tumorali con espressione di SIPA1L3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.