Smurf1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401196-ACT

SMURF1 codifica per Smurf1, una ligasi E3 dell’ubiquitina con dominio HECT che regola il turnover proteico in reti di segnalazione chiave, incluse le vie TGF-β/BMP-SMAD, WNT/polarità planare cellulare e il rimodellamento del citoscheletro tramite la segnalazione di RhoA. Catalizzando l’ubiquitinazione dei componenti delle vie, Smurf1 influenza la transizione epitelio-mesenchimale, la migrazione cellulare e la differenziazione osteogenica. Un’alterata attività di SMURF1 è stata collegata a una deregolazione della segnalazione dei fattori di crescita e a processi anomali di rimodellamento tissutale implicati nella biologia del cancro, nella fibrosi e nell’omeostasi scheletrica. Queste funzioni rendono SMURF1 un bersaglio utile per studi meccanicistici sulla proteostasi mediata dall’ubiquitina e sul crosstalk tra vie di segnalazione.

Smurf1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SMURF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Smurf1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SMURF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SMURF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Smurf1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SMURF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Smurf1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Smurf1 nelle cellule tumorali con espressione di SMURF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.