SMU1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404541-ACT

SMU1 (suppressor of mec-8 and unc-52 homolog 1) codifica un fattore conservato di splicing del pre-mRNA che si associa allo spliceosoma e supporta la rimozione accurata degli introni e la definizione degli esoni. Attraverso le sue interazioni con altri regolatori dello splicing, SMU1 contribuisce all’integrità del trascrittoma, alle decisioni di splicing alternativo e al controllo a valle della progressione del ciclo cellulare e dei programmi di espressione genica responsivi allo stress. L’alterazione dello splicing dipendente da SMU1 può spostare l’equilibrio delle isoforme e modificare l’espressione di geni coinvolti nel mantenimento del genoma e nella proliferazione. Di conseguenza, un’attività spliceosomiale disregolata che coinvolge SMU1 è di interesse negli studi sui difetti di processamento dell’RNA legati a firme di splicing associate al cancro e ad altri disturbi guidati da una maturazione aberrante dell’mRNA.

SMU1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SMU1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SMU1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SMU1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SMU1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SMU1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SMU1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SMU1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SMU1 nelle cellule tumorali con espressione di SMU1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.