SMP30 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401934-ACT

Il gene umano RGN codifica per la proteina marcatore della senescenza 30 (SMP30), una proteina citosolica multifunzionale implicata nell’invecchiamento cellulare, nelle risposte allo stress ossidativo e nell’omeostasi del calcio. SMP30 è stata collegata alla regolazione della gestione delle specie reattive dell’ossigeno, al metabolismo degli epatociti e al mantenimento della stabilità di membrana sotto stress, integrandosi con vie che influenzano la sopravvivenza cellulare e la resilienza dei tessuti. Alterazioni dell’espressione di SMP30 sono state associate al declino funzionale legato all’età e alla disregolazione metabolica nel fegato e in altri tessuti, rendendo RGN un nodo utile per studi meccanicistici dei fenotipi associati alla senescenza. In quanto fattore di risposta allo stress conservato, SMP30 viene spesso esaminata in modelli di infiammazione, squilibrio redox e fallimento dell’omeostasi cellulare.

SMP30 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RGN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SMP30 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RGN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RGN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SMP30. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RGN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SMP30 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SMP30 nelle cellule tumorali con espressione di RGN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.