SMG5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406989-ACT

SMG5 codifica un componente centrale e conservato del macchinario di degradazione dell’mRNA mediata da nonsense (NMD), che salvaguarda l’integrità del trascrittoma promuovendo il riconoscimento e la rimozione di mRNA aberranti. SMG5 si associa a UPF1 fosforilato e collabora con SMG6 e SMG7 per coordinare la defosforilazione di UPF1 tramite PP2A e le successive fasi di degradazione, collegando la sorveglianza alla terminazione della traduzione e al controllo di qualità dell’RNA. Attraverso l’NMD, SMG5 influenza programmi di espressione genica, risposte allo stress e proteostasi limitando l’accumulo di trascritti contenenti codoni di stop prematuri e di alcune isoforme fisiologiche di mRNA. Una NMD deregolata è stata implicata in diversi contesti rilevanti per la malattia, tra cui il rimodellamento del trascrittoma associato al cancro e disturbi genetici guidati da varianti nonsense, rendendo SMG5 un nodo utile per studi meccanicistici di biologia dell’RNA.

SMG5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SMG5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SMG5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SMG5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SMG5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SMG5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SMG5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SMG5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SMG5 nelle cellule tumorali con espressione di SMG5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.