Plasmide CRISPR d'Activation (h) SmcY: sc-403217-ACT

KDM5D code la lysine déméthylase SmcY (JARID1D) liée au chromosome Y, un régulateur de la chromatine qui enlève les marques H3K4me2/3 afin de moduler les programmes transcriptionnels. Par son rôle dans le contrôle épigénétique, SmcY contribue au maintien de l’identité cellulaire, à la régulation de l’expression des gènes associés à la prolifération et à la coordination de l’état de la chromatine avec des processus dépendants de l’ADN tels que la réplication et la réparation. Des altérations de l’activité de la famille KDM5 ont été impliquées dans des réseaux transcriptionnels dérégulés dans des contextes de cancer et de développement, et KDM5D lui-même est fréquemment étudié en lien avec la biologie spécifique au sexe et la perte du chromosome Y dans les tissus somatiques. Ces caractéristiques font de KDM5D un modèle utile pour explorer comment la déméthylation des histones façonne les réponses des voies de signalisation et les phénotypes cellulaires.

SmcY Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KDM5D sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SmcY Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KDM5D dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KDM5D, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SmcY. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KDM5D natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SmcY au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SmcY dans les cellules tumorales présentant une expression de KDM5D silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.