SMARCD2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403091-ACT

SMARCD2 (noto anche come BAF60B) codifica una subunità accessoria core del complesso di rimodellamento della cromatina SWI/SNF (BAF) ATP-dipendente, che contribuisce ad accoppiare i fattori di trascrizione specifici di sequenza al riposizionamento dei nucleosomi. Attraverso la regolazione dell’accessibilità della cromatina, SMARCD2 influenza programmi trascrizionali specifici di linea che controllano la differenziazione ematopoietica, la maturazione delle cellule immunitarie e l’espressione genica responsiva agli stimoli. Questa attività di rimodellamento della cromatina si integra con vie che regolano l’inizio della trascrizione, la funzione degli enhancer e il mantenimento dello stato epigenetico durante lo sviluppo e le risposte allo stress. Alterazioni del dosaggio o della funzione delle subunità SWI/SNF sono ampiamente rilevanti per la differenziazione deregolata e i circuiti trascrizionali oncogenici, rendendo SMARCD2 un bersaglio utile per studi meccanicistici della biologia delle malattie guidate dalla cromatina.

SMARCD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SMARCD2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SMARCD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SMARCD2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SMARCD2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SMARCD2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SMARCD2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SMARCD2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SMARCD2 nelle cellule tumorali con espressione di SMARCD2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.