SMARCA4/Brg1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400168-ACT

SMARCA4 (Brg1) codifica la componente ATPasica centrale del complesso di rimodellamento della cromatina SWI/SNF (BAF), che riposiziona i nucleosomi per regolare programmi trascrizionali che controllano identità cellulare, proliferazione e differenziamento. Attraverso un rimodellamento dipendente dall’ATP, SMARCA4 influenza l’accessibilità degli enhancer e, in coordinamento con fattori di trascrizione che definiscono la linea cellulare, modula l’attività della RNA polimerasi II. Partecipa a processi quali la segnalazione del danno al DNA, le risposte allo stress replicativo e il controllo dei checkpoint del ciclo cellulare, plasmando l’architettura della cromatina in loci regolatori chiave. La deregolazione o la perdita della funzione di SMARCA4 è ricorrente in molteplici contesti tumorali, collegando un’alterata attività di SWI/SNF alla riprogrammazione epigenetica, all’instabilità genomica e a un output anomalo delle vie di sviluppo.

SMARCA4/Brg1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SMARCA4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SMARCA4/Brg1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SMARCA4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SMARCA4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SMARCA4/Brg1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SMARCA4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SMARCA4/Brg1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SMARCA4/Brg1 nelle cellule tumorali con espressione di SMARCA4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.