Smad7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400251-ACT

SMAD7 codifica Smad7, uno SMAD inibitorio che funge da principale regolatore negativo della segnalazione TGF-β e BMP, interferendo con la fosforilazione degli R-SMAD mediata dai recettori e promuovendo la downregulation dei recettori. Attraverso la modulazione di programmi trascrizionali dipendenti da SMAD, Smad7 influenza la transizione epitelio-mesenchimale, il rimodellamento della matrice extracellulare, il controllo del ciclo cellulare e il crosstalk con la segnalazione infiammatoria. Alterazioni dell’espressione di SMAD7 sono state associate a risposte fibrotiche deregolate, a un’omeostasi immunitaria compromessa e a un controllo della crescita aberrante in molteplici contesti tissutali. Queste connessioni di via rendono SMAD7 un bersaglio utile per analizzare la regolazione a feedback all’interno delle reti TGF-β/BMP e i relativi output trascrizionali a valle.

Smad7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SMAD7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Smad7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SMAD7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SMAD7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Smad7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SMAD7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Smad7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Smad7 nelle cellule tumorali con espressione di SMAD7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.