Smad6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401411-ACT

SMAD6 umano codifica Smad6, uno SMAD inibitorio che attenua la segnalazione a valle della superfamiglia TGF-β, in particolare del ramo BMP. Smad6 agisce come regolatore di feedback negativo interferendo con la fosforilazione degli SMAD regolati dal recettore e modulando la formazione dei complessi SMAD e l’output trascrizionale. Attraverso questi meccanismi influenza il patterning dello sviluppo, la differenziazione osteogenica, l’omeostasi endoteliale e vascolare e il crosstalk con la segnalazione infiammatoria. Alterazioni dell’attività o dell’espressione di SMAD6 sono state associate a fenotipi congeniti cardiovascolari e craniofacciali e sono state studiate in contesti in cui uno squilibrio della via BMP/TGF-β contribuisce a processi di rimodellamento e calcificazione rilevanti per la malattia.

Smad6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SMAD6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Smad6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SMAD6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SMAD6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Smad6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SMAD6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Smad6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Smad6 nelle cellule tumorali con espressione di SMAD6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.