SLBP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403637-ACT

La proteina legante lo stem-loop (SLBP) è un fattore conservato legante l’RNA che riconosce la struttura a stelo–ansa (stem–loop) al 3′ degli mRNA degli istoni dipendenti dalla replicazione, coordinandone la maturazione, l’esportazione nucleare, la traduzione e la rapida degradazione al termine della fase S. Accoppiando la disponibilità di istoni alla replicazione del DNA, SLBP sostiene l’assemblaggio della cromatina, la stabilità del genoma e una progressione ordinata del ciclo cellulare, integrandosi con i checkpoint della fase S e con le vie di risposta al danno al DNA. Un’attività di SLBP deregolata può alterare l’omeostasi degli istoni, causando stress replicativo, modifiche del paesaggio della cromatina e instabilità trascrizionale. Di conseguenza, SLBP è spesso studiata in contesti di biologia della proliferazione e di deregolazione del ciclo cellulare associata ai tumori, come nodo meccanicistico che collega il processamento dell’RNA al mantenimento della cromatina.

SLBP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLBP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SLBP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLBP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLBP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SLBP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLBP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SLBP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SLBP nelle cellule tumorali con espressione di SLBP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.