Six6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405096-ACT

SIX6 codifica il fattore di trascrizione homeobox Six6, un regolatore nucleare legante il DNA essenziale per lo sviluppo embrionale dell’occhio e del prosencefalo e per il mantenimento dell’identità delle cellule neuroretiniche. Six6 modula programmi di espressione genica che controllano la proliferazione dei progenitori, la tempistica del ciclo cellulare e la specificazione di linea, interfacciandosi con reti di segnalazione dello sviluppo che includono segnali WNT, SHH e BMP. Alterazioni del dosaggio di SIX6 o variazioni regolatorie sono state associate a fenotipi oculari, come anomalie dello sviluppo della papilla del nervo ottico e della retina, e a un rischio genetico per tratti correlati al glaucoma, a supporto della sua rilevanza nella biologia delle malattie neuroevolutive e oculari. In quanto regolatore trascrizionale, Six6 è spesso studiato in modelli di differenziazione retinica, decisioni di destino neuronale e architettura delle reti di regolazione genica.

Six6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SIX6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Six6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SIX6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SIX6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Six6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SIX6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Six6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Six6 nelle cellule tumorali con espressione di SIX6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.