SIRT5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416994-ACT

Il SIRT5 umano codifica una sirtuina mitocondriale NAD+-dipendente che funge principalmente da desuccinilasi, demalonilasi e deglutarilasi delle lisine, rimodellando così il panorama delle acilazioni degli enzimi metabolici. Regolando bersagli nel ciclo del TCA, nell’ossidazione degli acidi grassi, nel metabolismo dei corpi chetonici e nel ciclo dell’urea, SIRT5 coordina l’omeostasi energetica mitocondriale e l’equilibrio redox in condizioni di disponibilità di nutrienti variabile. Un’attività alterata di SIRT5 è stata associata a disfunzione mitocondriale, risposte allo stress ossidativo e a un rimodellamento del metabolismo intermedio osservato in diversi stati cellulari legati alla malattia, inclusi la biologia del cancro e fenotipi connessi a condizioni cardiometaboliche e alla neurodegenerazione. Queste caratteristiche rendono SIRT5 un nodo utile per studiare il controllo post-traduzionale delle vie mitocondriali e il metabolismo adattativo allo stress.

SIRT5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SIRT5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SIRT5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SIRT5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SIRT5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SIRT5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SIRT5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SIRT5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SIRT5 nelle cellule tumorali con espressione di SIRT5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.