SIP1/ZEB2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400655-ACT

ZEB2, noto anche come SIP1, è un fattore di trascrizione a dita di zinco che si lega alle E-box e regola la transizione epitelio-mesenchimale (EMT) reprimendo i programmi genici epiteliali, incluso CDH1, e coordinando il destino cellulare e la differenziazione. Attraverso le sue interazioni con le proteine SMAD, SIP1/ZEB2 integra la segnalazione TGF-β/BMP con il rimodellamento della cromatina per controllare la specificazione di linea, la migrazione e la definizione dei pattern di sviluppo. L’attività di ZEB2 modella lo sviluppo della cresta neurale e dell’ematopoiesi e modula la differenziazione delle cellule immunitarie, collegandolo a vie che governano la morfogenesi dei tessuti e le risposte infiammatorie. La disregolazione delle reti trascrizionali associate a ZEB2 è stata implicata in disturbi dello sviluppo e in programmi di plasticità cellulare rilevanti per la progressione tumorale e fenotipi associati alla metastasi.

SIP1/ZEB2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ZEB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SIP1/ZEB2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ZEB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ZEB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SIP1/ZEB2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ZEB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SIP1/ZEB2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SIP1/ZEB2 nelle cellule tumorali con espressione di ZEB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.