Sigma Receptor Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422068-ACT

Sigmar1 codifica il recettore sigma-1, uno chaperone di membrana del reticolo endoplasmatico (RE) arricchito nelle membrane del RE associate ai mitocondri, dove modula lo scambio di Ca2+ tra RE e mitocondri, la proteostasi e le risposte cellulari allo stress. Il recettore sigma-1 interagisce con canali ionici e complessi di segnalazione influenzando la neurotrasmissione, il rimodellamento lipidico e l’omeostasi redox, integrando vie collegate alla risposta alle proteine mal ripiegate e alla bioenergetica mitocondriale. Nei modelli murini, l’attività di Sigmar1 è stata collegata al mantenimento dei neuroni, alla plasticità sinaptica e alla regolazione della segnalazione infiammatoria in contesti gliali e del sistema immunitario periferico. La disregolazione dell’omeostasi dipendente dal recettore sigma-1 è oggetto di studio in modelli di neurodegenerazione, dolore neuropatico e stress cardiometabolico, a supporto della sua rilevanza per l’analisi dei meccanismi di via.

Sigma Receptor Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Sigmar1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Sigma Receptor Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Sigmar1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Sigmar1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Sigma Receptor. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Sigmar1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Sigma Receptor nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Sigma Receptor nelle cellule tumorali con espressione di Sigmar1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.