SHOX2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402950-ACT

SHOX2 (short stature homeobox 2) codifica un fattore di trascrizione homeobox che regola programmi genici dello sviluppo responsabili dell’identità cellulare, della differenziazione e della definizione dei pattern tissutali. Nelle cellule umane, SHOX2 contribuisce a reti trascrizionali che modellano la cardiogenesi e la specificazione della linea dei pacemaker e può influenzare caratteristiche epitelio-mesenchimali attraverso la modulazione di bersagli a valle. Alterazioni dell’espressione di SHOX2 e della metilazione del suo promotore sono state collegate alla riprogrammazione trascrizionale associata al cancro e a fenotipi dello sviluppo che coinvolgono la conduzione cardiaca e tratti legati alla crescita. In quanto regolatore che si lega al DNA, SHOX2 rappresenta un nodo facilmente studiabile per analizzare i circuiti di regolazione genica, gli effetti dello stato della cromatina e il controllo trascrizionale ristretto a specifiche linee cellulari.

SHOX2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SHOX2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SHOX2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SHOX2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SHOX2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SHOX2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SHOX2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SHOX2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SHOX2 nelle cellule tumorali con espressione di SHOX2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.