Shh Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-422926-LAC

Sonic hedgehog (Shh) codifica un morfogeno secreto che orchestra il patterning embrionale e la morfogenesi dei tessuti stabilendo segnali dipendenti dalla concentrazione. Dopo la processazione e la secrezione del ligando, SHH si lega a PTCH1 alleviando l’inibizione di SMO e attivando i fattori di trascrizione GLI, che regolano programmi di controllo della proliferazione, della differenziazione e del destino delle cellule staminali/progenitrici. Nella biologia del topo, la segnalazione Shh è centrale per la ventralizzazione del tubo neurale, lo sviluppo della gemma dell’arto e l’organogenesi, e una sua deregolazione altera le reti geniche dello sviluppo. Un’attività aberrante della via SHH–PTCH–SMO–GLI è inoltre associata a contesti di segnalazione oncogena e al rimodellamento del microambiente tumorale, rendendo Shh un nodo chiave per l’analisi della via.

Le particelle di attivazione lentivirale Shh (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Shh in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Shh (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Shh, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Shh. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Shh e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.