Separase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404170-ACT

ESPL1 codifica per la separasi, un’endopeptidasi a cisteina che innesca la separazione dei cromatidi fratelli in anafase scindendo componenti del complesso della coesina, consentendo una corretta segregazione cromosomica durante mitosi e meiosi. L’attività della separasi è rigidamente controllata dal legame con la securina e da fosforilazioni inibitorie fino all’attivazione mediata dalla proteolisi dipendente dall’APC/C, coordinando la transizione metafase–anafase e il completamento della citocinesi. Un’espressione deregolata di ESPL1 o l’iperattività della separasi possono favorire instabilità cromosomica e aneuploidia, collegando questa via a difetti di mantenimento del genoma osservati in diversi contesti oncologici. ESPL1 è inoltre utilizzato come nodo meccanicistico per studiare il controllo del checkpoint di assemblaggio del fuso, la tempistica del ciclo cellulare e le dinamiche di instaurazione/rimozione della coesione.

Separase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ESPL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Separase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ESPL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ESPL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Separase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ESPL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Separase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Separase nelle cellule tumorali con espressione di ESPL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.