Sec61β Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402791-ACT

SEC61B codifica Sec61β, una piccola subunità del traslocone eterotrimerico Sec61 incorporato nella membrana del reticolo endoplasmatico (RE), che supporta l’importazione co-traduzionale delle proteine e l’integrazione delle proteine di membrana. Collegando l’ancoraggio del ribosoma al RE e coordinandosi con la via della particella di riconoscimento del segnale (SRP), Sec61β contribuisce alla proteostasi della via secretoria e ai processi di controllo qualità del RE legati alla risposta alle proteine non correttamente ripiegate (UPR) e alla degradazione associata al RE (ERAD). Alterazioni nel traffico dipendente dal traslocone possono influenzare la maturazione di recettori, canali e fattori secreti, rendendo SEC61B rilevante per studi su stress del RE, squilibrio del proteoma e meccanismi più ampi che modellano l’omeostasi cellulare. Poiché il complesso Sec61 influisce anche sulla presentazione dell’antigene e sulla biogenesi di regolatori immunitari e metabolici, SEC61B è spesso analizzato in screening di genomica funzionale volti a indagare l’adattamento allo stress e fenotipi legati alla gestione delle proteine.

Sec61β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SEC61B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Sec61β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SEC61B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SEC61B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Sec61β. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SEC61B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Sec61β nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Sec61β nelle cellule tumorali con espressione di SEC61B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.