SEC23 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403549-ACT

O SEC23A humano codifica a SEC23, um componente essencial do revestimento COPII que media o brotamento de vesículas a partir de sítios de saída do retículo endoplasmático e a seleção de carga para o transporte do RE para o Golgi. A SEC23 atua em coordenação com a SEC24 e a GTPase SAR1 para promover a montagem do revestimento, contribuindo para o fluxo da via secretória, a proteostase e a maturação adequada da matriz extracelular e de proteínas de membrana. A disrupção do tráfego COPII pode alterar a glicosilação, as respostas ao estresse do RE e redes de sinalização dependentes de secreção importantes no desenvolvimento e na homeostase tecidual. Variações patogênicas em SEC23A foram associadas a fenótipos craniofaciais e esqueléticos, tornando o SEC23A um ponto útil para estudar mecanismos de doença relacionados à secreção em modelos de células humanas.

SEC23A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SEC23A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SEC23A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SEC23A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SEC23A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SEC23A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SEC23A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SEC23A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SEC23A em células tumorais com expressão de SEC23A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.