SDF-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404598-ACT

SDF2 codifica il fattore 2 derivato dalle cellule stromali (SDF-2), una proteina residente nel reticolo endoplasmatico (RE) implicata nell’omeostasi della via secretoria e nel controllo qualità delle proteine. SDF-2 è associata alla segnalazione dello stress del RE e a risposte adattative che favoriscono il corretto ripiegamento, la maturazione e il traffico delle proteine “clienti” all’interno del sistema secretorio precoce. Attraverso il suo legame con la proteostasi e con processi correlati alla risposta alle proteine mal ripiegate (unfolded protein response, UPR), un’alterata attività di SDF2 è rilevante per i fenotipi cellulari osservati in condizioni in cui la funzione del RE e la secrezione risultano compromesse, inclusi l’adattamento allo stress associato al cancro e i microambienti infiammatori. Modulando l’espressione di SDF2 è quindi possibile analizzare come la proteostasi del RE si interfacci con output di segnalazione che influenzano la sopravvivenza cellulare, la differenziazione e la capacità secretoria.

SDF-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SDF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SDF-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SDF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SDF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SDF-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SDF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SDF-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SDF-2 nelle cellule tumorali con espressione di SDF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.