SCCA1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403601-ACT

SERPINB3 codifica l’antigene 1 del carcinoma a cellule squamose (SCCA1), un inibitore intracellulare delle serin-proteasi della famiglia delle serpine che modula la proteostasi guidata dalle proteasi e le risposte allo stress dell’epitelio. SCCA1 può limitare l’attività di proteasi di tipo catepsina e chimasi, influenzando l’integrità lisosomiale, la processazione dell’antigene e i programmi di segnalazione apoptotici o infiammatori negli epiteli differenziati. Un’espressione disregolata di SERPINB3 è stata associata al rimodellamento epiteliale e a fenotipi immuno-correlati osservati in contesti di neoplasie squamose, rendendolo un marcatore utile e un nodo funzionale per studiare l’infiammazione associata al tumore e le vie di sopravvivenza cellulare. Nei modelli cellulari, la perturbazione di SERPINB3 viene comunemente valutata insieme alle vie che regolano lo stress ossidativo, la segnalazione citochinica e la differenziazione epiteliale.

SCCA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SERPINB3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SCCA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SERPINB3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SERPINB3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SCCA1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SERPINB3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SCCA1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SCCA1 nelle cellule tumorali con espressione di SERPINB3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.