SAV1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402600-ACT

SAV1 umano (Salvador family WW domain containing protein 1) è un’impalcatura centrale della via oncosoppressiva Hippo, che coordina la segnalazione delle chinasi MST1/2 e LATS1/2 per limitare i programmi trascrizionali guidati da YAP/TAZ. Promuovendo la ritenzione citoplasmatica e la degradazione di YAP/TAZ dipendenti dalla fosforilazione, SAV1 contribuisce a regolare l’inibizione da contatto, il controllo della proliferazione, l’apoptosi e l’omeostasi tissutale. Un’alterata espressione di SAV1 o la disfunzione della via Hippo sono state collegate a una crescita cellulare deregolata e a stati di differenziamento anomali in molteplici contesti rilevanti per la malattia, in particolare quelli caratterizzati da un’attività aberrante di YAP/TAZ. SAV1 è quindi ampiamente studiato in vie che intersecano la dinamica del citoscheletro, la polarità cellulare, la meccanotrasduzione e il controllo delle dimensioni degli organi.

SAV1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SAV1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SAV1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SAV1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SAV1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SAV1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SAV1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SAV1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SAV1 nelle cellule tumorali con espressione di SAV1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.