SAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402165-ACT

APCS codifica il componente P dell’amiloide sierica (SAP), una glicoproteina della famiglia delle pentrassine che si lega in modo calcio-dipendente a polisaccaridi microbici, detriti nucleari e fibrille amiloidi, influenzando l’opsonizzazione e i processi dell’immunità innata correlati al complemento. SAP partecipa a vie di riconoscimento di pattern e di rimozione interagendo con recettori Fc e componenti del complemento, modulando la segnalazione infiammatoria e l’omeostasi tissutale. Alterazioni dell’abbondanza di SAP o della sua attività di legame sono state associate alla biologia della deposizione amiloide e a stati infiammatori deregolati, rendendo APCS un bersaglio utile per studiare complessi proteici associati alla matrice extracellulare e i meccanismi di sorveglianza immunitaria. Nei sistemi umani, SAP è anche utilizzata come readout molecolare per la modulazione, mediata dalle pentrassine, del legame di ligandi solubili e della gestione di proteine inclini all’aggregazione.

SAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di APCS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus APCS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione APCS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus APCS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SAP nelle cellule tumorali con espressione di APCS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.