Rock-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400367-ACT

ROCK1 umano codifica la chinasi serina/treonina Rock-1, un principale effettore a valle di RhoA che regola la contrattilità actomiosinica, la formazione delle fibre da stress, la dinamica delle adesioni focali e il rimodellamento delle giunzioni cellula–cellula. La segnalazione di Rock-1 si integra con le vie del citoscheletro e della meccanotrasduzione per controllare forma cellulare, adesione, migrazione e citocinesi, e può influenzare l’apoptosi e i programmi trascrizionali tramite la fosforilazione di substrati quali MYPT1 e le chinasi LIM. Un’attività di ROCK1 deregolata è stata associata ad alterazioni della rigidità tissutale e a fenotipi invasivi nella biologia del cancro, nonché a disfunzione della muscolatura liscia vascolare e a rimodellamento infiammatorio rilevanti per i meccanismi delle malattie cardiovascolari e fibrotiche. Queste proprietà rendono ROCK1 un nodo ampiamente utilizzato per studiare la regolazione citoscheletrica guidata da Rho/ROCK e il cross-talk di segnalazione in modelli cellulari umani.

Rock-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ROCK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rock-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ROCK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ROCK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rock-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ROCK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rock-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rock-1 nelle cellule tumorali con espressione di ROCK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.