RNGTT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405280-ACT

L’RNGTT umano codifica la RNA guanililtransferasi e 5′-fosfatasi che catalizza passaggi chiave del cappuccio 5′ dell’mRNA, convertendo i 5′-trifosfati dell’RNA nascente nel cap m7G in coordinamento con le metiltransferasi e la macchina trascrizionale. Questa struttura di cap è essenziale per la maturazione del pre-mRNA, l’esportazione nucleare, l’inizio della traduzione e la protezione dagli esonucleasi, collegando l’attività di RNGTT alla trascrizione accoppiata alla RNA polimerasi II e ai programmi globali di espressione genica. Influenzando la stabilità dell’mRNA e l’efficienza di traduzione, RNGTT interseca vie che regolano la progressione del ciclo cellulare, le risposte allo stress e il riconoscimento immunitario innato dell’RNA privo di cap. La disregolazione del capping dell’mRNA e del controllo della traduzione cap-dipendente è ampiamente rilevante per la biologia delle malattie proliferative e del neurosviluppo, rendendo RNGTT un nodo utile per studi meccanicistici del metabolismo dell’RNA.

RNGTT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RNGTT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RNGTT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RNGTT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RNGTT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RNGTT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RNGTT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RNGTT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RNGTT nelle cellule tumorali con espressione di RNGTT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.