RNF8 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-401909-LAC

L’RNF8 umano codifica una ligasi E3 dell’ubiquitina con dominio RING finger che coordina la risposta al danno al DNA catalizzando la segnalazione mediata da ubiquitina nei siti di rotture a doppio filamento del DNA. Attraverso il crosstalk con le vie ATM/ATR, RNF8 promuove il reclutamento e la ritenzione di fattori chiave della riparazione, tra cui 53BP1, BRCA1 e complessi a valle dipendenti dall’ubiquitina che regolano l’attivazione dei checkpoint e la scelta della via di riparazione. RNF8 è inoltre implicata nel rimodellamento della cromatina e nel mantenimento della stabilità genomica, collegando la sua attività a esiti cellulari quali arresto del ciclo cellulare, apoptosi e senescenza in condizioni di stress genotossico. Una ubiquitinazione dipendente da RNF8 deregolata è stata associata a fenotipi di instabilità genomica e a un’alterata segnalazione del danno osservata in molteplici contesti rilevanti per il cancro e in altri disordini della riparazione del DNA.

Le particelle di attivazione lentivirale RNF8 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di RNF8 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale RNF8 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione RNF8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di RNF8. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo RNF8 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.