RNF4 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-422689-LAC

Il gene murino Rnf4 codifica RNF4, una ligasi E3 dell’ubiquitina mirata da SUMO che riconosce substrati poli-SUMOilati tramite motivi di interazione con SUMO e ne promuove l’ubiquitinazione e la degradazione mediata dal proteasoma. RNF4 integra la segnalazione SUMO e ubiquitina per regolare le risposte al danno al DNA, lo stress replicativo, il controllo trascrizionale e il mantenimento della stabilità del genoma. Modulando il destino dei fattori di riparo SUMOilati e delle proteine associate alla cromatina, RNF4 influenza la progressione del ciclo cellulare e l’adattamento cellulare allo stress genotossico. Un’attività disregolata di RNF4 è stata collegata ad anomalie della proteostasi e a fenotipi di instabilità genomica rilevanti per la biologia del cancro e per vie correlate di risposta allo stress.

Le particelle di attivazione lentivirale RNF4 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Rnf4 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale RNF4 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Rnf4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di RNF4. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Rnf4 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.