RNF185 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-416413-ACT

RNF185は、主に小胞体およびミトコンドリア関連膜に局在するRINGフィンガー型E3ユビキチンリガーゼをコードしており、タンパク質品質管理とオルガネラ恒常性の調節に関与します。特定の基質のユビキチン化を触媒することで、RNF185はER関連分解（ERAD）やストレス適応シグナル伝達などのプロテオスタシス経路に影響を与え、その下流でミトコンドリア動態にも作用します。選択的オートファジーや自然免疫制御における役割も報告されており、損傷したタンパク質やオルガネラに対する細胞応答を統合する仕組みとRNF185が結び付けられています。ユビキチンシグナルの破綻とプロテオスタシス不全は、神経変性疾患、代謝疾患、がん生物学に共通して見られる特徴であるため、RNF185は経路に焦点を当てた研究における有用なハブ（ノード）となります。

RNF185 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性RNF185の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

RNF185 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における RNF185 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はRNF185転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性RNF185の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のRNF185遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるRNF185依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびRNF185発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるRNF185経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。