RNF185 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416413-ACT

RNF185 codifica una ligasi E3 dell’ubiquitina con dominio RING finger, associata principalmente al reticolo endoplasmatico e alle membrane associate ai mitocondri (MAM), dove contribuisce a regolare il controllo qualità delle proteine e l’omeostasi degli organelli. Catalizzando l’ubiquitinazione di specifici substrati, RNF185 influenza vie di proteostasi tra cui la degradazione associata al RE (ERAD) e la segnalazione adattativa allo stress, con effetti a valle sulla dinamica mitocondriale. I ruoli riportati nell’autofagia selettiva e nella regolazione dell’immunità innata collegano RNF185 a meccanismi che coordinano le risposte cellulari a proteine e organelli danneggiati. La deregolazione della segnalazione mediata dall’ubiquitina e la compromissione della proteostasi sono caratteristiche ricorrenti nella neurodegenerazione, nei disturbi metabolici e nella biologia del cancro, rendendo RNF185 un nodo utile per ricerche focalizzate sulle vie di segnalazione.

RNF185 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RNF185 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RNF185 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RNF185 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RNF185, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RNF185. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RNF185 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RNF185 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RNF185 nelle cellule tumorali con espressione di RNF185 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.