RIP Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422681-ACT

Ripk1 codifica la chinasi serina/treonina 1 che interagisce con il recettore (RIPK1/RIP), un regolatore chiave delle decisioni sul destino cellulare a valle del recettore del TNF, dei TLR e della segnalazione immunitaria innata citosolica. RIPK1 integra la segnalazione pro-sopravvivenza mediata da NF-κB con le vie apoptotiche e necroptotiche attraverso interazioni con RIPK3, MLKL e la caspasi-8, coordinando gli output infiammatori e le risposte allo stress. Nei modelli murini, un’alterazione dell’attività di RIPK1 è associata a una segnalazione citochinica disregolata, danno tissutale e fenotipi neuroinfiammatori, rendendolo un nodo ampiamente utilizzato per studiare la patologia associata all’infiammazione e la morte cellulare regolata.

RIP Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ripk1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RIP Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ripk1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ripk1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RIP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ripk1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RIP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RIP nelle cellule tumorali con espressione di Ripk1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.