Rictor Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400710-ACT

RICTOR codifica Rictor, un componente di impalcatura essenziale del complesso mTOR 2 (mTORC2), che coordina la segnalazione delle chinasi per regolare sopravvivenza cellulare, proliferazione, metabolismo e organizzazione del citoscheletro. Attraverso la fosforilazione, dipendente da mTORC2, di chinasi della famiglia AGC, tra cui AKT (Ser473), SGK e le isoforme di PKC, Rictor contribuisce alla modulazione della via PI3K–AKT, alla segnalazione insulinica e alla dinamica dell’actina. Un’espressione alterata di RICTOR o un’attività anomala di mTORC2 sono spesso associate alla deregolazione della segnalazione dei fattori di crescita e alla riprogrammazione metabolica osservate in diversi contesti di cancro e malattie metaboliche. In quanto nodo centrale nella percezione di nutrienti e fattori di crescita, Rictor è ampiamente studiato nei meccanismi di resistenza ai farmaci, migrazione e differenziamento specifico di linea.

Rictor Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RICTOR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rictor Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RICTOR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RICTOR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rictor. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RICTOR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rictor nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rictor nelle cellule tumorali con espressione di RICTOR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.