RHBDL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405676-ACT

RHBDL1 (rhomboid-like 1) codifica una proteasi intramembrana a serina della famiglia delle romboidi, localizzata nelle membrane cellulari, che regola il controllo di qualità proteico attraverso l’elaborazione proteolitica di substrati incorporati nella membrana. Influenzando il turnover di specifiche proteine “client”, RHBDL1 contribuisce a vie di proteostasi che si intersecano con la degradazione associata al reticolo endoplasmatico (ERAD), il traffico delle proteine di membrana e la segnalazione adattativa allo stress. Un’attività alterata delle proteasi intramembrana è stata collegata a una deregolazione della segnalazione cellulare e al rimodellamento del proteoma nel cancro e in altri disturbi caratterizzati da stress cellulare cronico, rendendo RHBDL1 un bersaglio rilevante per studi meccanicistici. Le dinamiche di espressione di RHBDL1 possono inoltre essere sfruttate per analizzare come la proteolisi di membrana modelli la reattività delle vie di segnalazione in diversi contesti cellulari umani.

RHBDL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RHBDL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RHBDL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RHBDL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RHBDL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RHBDL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RHBDL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RHBDL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RHBDL1 nelle cellule tumorali con espressione di RHBDL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.