RHAMM Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402431-ACT

HMMR codifica RHAMM (recettore della motilità mediata dall’ialuronano), una proteina multifunzionale che lega l’ialuronano e interagisce con regolatori del citoscheletro per coordinare la motilità cellulare, la polarità e la segnalazione guidata dalla matrice extracellulare. RHAMM si localizza sulla superficie cellulare, nel citoplasma e nel fuso mitotico, dove contribuisce alla dinamica dei microtubuli, alla funzione del centrosoma e alla progressione della mitosi attraverso vie che includono la segnalazione ERK/MAPK e il controllo dell’assemblaggio del fuso. Un’espressione deregolata di HMMR è stata associata a fenotipi alterati di migrazione e proliferazione ed è spesso studiata nel contesto dell’invasione delle cellule tumorali, di programmi associati alla metastasi e della regolazione aberrante del ciclo cellulare. Di conseguenza, RHAMM rappresenta un nodo utile per analizzare la segnalazione ialuronano–ECM, il rimodellamento del citoscheletro e le risposte allo stress legate alla mitosi in modelli cellulari umani.

RHAMM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HMMR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RHAMM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HMMR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HMMR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RHAMM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HMMR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RHAMM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RHAMM nelle cellule tumorali con espressione di HMMR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.