REV1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402251-ACT

Il gene umano **REV1** codifica una DNA polimerasi della famiglia Y che funge da piattaforma di assemblaggio e da enzima specializzato nella sintesi translesione durante la tolleranza al danno del DNA. REV1 coordina l’inserzione nucleotidica di fronte a basi danneggiate e recluta la polimerasi ζ attraverso interazioni con REV7/MAD2L2 e altri fattori della TLS, aiutando le forcelle di replicazione a bypassare voluminosi addotti al DNA. Questa attività si integra con le risposte allo stress replicativo, la riparazione post-replicativa e le vie di stabilità genomica, nelle quali un’alterazione dell’equilibrio della TLS può influenzare la mutagenesi e la sensibilità cellulare allo stress genotossico. REV1 è quindi ampiamente studiato nei meccanismi di riparazione del DNA, fedeltà della replicazione e accumulo di mutazioni rilevanti per la biologia del cancro e per altre condizioni associate all’instabilità genomica.

REV1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di REV1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

REV1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus REV1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione REV1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di REV1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus REV1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da REV1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via REV1 nelle cellule tumorali con espressione di REV1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.