Ref-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400932-ACT

APEX1 codifica Ref-1 (APE1), un’endonucleasi apurinica/apirimidinica essenziale che coordina la riparazione per escissione di basi (BER) clivando i siti abasic del DNA generati in seguito a danno ossidativo, alchilazione o perdita spontanea di basi. Oltre alla riparazione del DNA, Ref-1 agisce anche come regolatore redox che modula l’attività di legame al DNA di fattori di trascrizione coinvolti nella segnalazione da stress e infiammatoria, tra cui AP-1, NF-κB e HIF-1. Attraverso questi ruoli, APEX1 sostiene la stabilità del genoma, la tolleranza al danno associato alla replicazione e le risposte cellulari alle specie reattive dell’ossigeno. Un’attività di APEX1 deregolata e un equilibrio redox/riparazione alterato sono stati associati alla biologia tumorale, alla neurodegenerazione e a patologie infiammatorie, rendendolo un nodo chiave per studi meccanicistici delle risposte al danno del DNA.

Ref-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di APEX1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ref-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus APEX1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione APEX1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ref-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus APEX1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ref-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ref-1 nelle cellule tumorali con espressione di APEX1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.