REEP5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405007-ACT

REEP5 (receptor expression-enhancing protein 5) è una proteina di membrana residente nel reticolo endoplasmatico (RE) che contribuisce a modellare i tubuli del RE e a sostenere l’organizzazione tra RE e membrana plasmatica, favorendo un traffico efficiente e l’espressione in superficie di specifici recettori e canali. Influenzando la curvatura di membrana e la dinamica della via secretoria, REEP5 incide su processi cellulari quali la maturazione proteica, il trasporto vescicolare e il mantenimento dell’omeostasi del RE. Alterazioni dell’attività di REEP5 sono state associate a perturbazioni della segnalazione recettoriale e dell’organizzazione di membrana, rendendola rilevante per studi sull’eccitabilità cellulare, l’adattamento allo stress e il riassetto delle vie di segnalazione in stati associati a malattia. REEP5 umano rappresenta quindi un bersaglio utile per analizzare la morfogenesi del RE e i meccanismi di traffico dei recettori che si intrecciano con le reti di segnalazione e con la fitness cellulare.

REEP5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di REEP5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

REEP5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus REEP5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione REEP5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di REEP5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus REEP5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da REEP5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via REEP5 nelle cellule tumorali con espressione di REEP5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.