RecQL4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403224-ACT

RECQL4 codifica l’elicasi del DNA umano RecQ RecQL4, un fattore di mantenimento del genoma necessario per l’avvio della replicazione del DNA, la stabilizzazione delle forcelle di replicazione in stallo e molteplici meccanismi di riparazione del DNA, inclusi la ricombinazione omologa e la riparazione per escissione di basi. RecQL4 opera all’interno della più ampia rete di risposta al danno del DNA per preservare l’integrità cromosomica durante la fase S e dopo stress genotossico. Un’attività di RECQL4 deregolata è associata a stress replicativo, instabilità cromosomica e a una sensibilità alterata agli agenti che danneggiano il DNA, rendendolo rilevante per lo studio delle vie di stabilità del genoma. Varianti patogene in RECQL4 sono associate a disturbi ereditari caratterizzati da difetti dello sviluppo e predisposizione al cancro, a supporto del suo impiego in modelli meccanicistici della disfunzione dei processi di riparazione del DNA legata alla malattia.

RecQL4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RECQL4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RecQL4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RECQL4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RECQL4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RecQL4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RECQL4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RecQL4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RecQL4 nelle cellule tumorali con espressione di RECQL4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.