Recoverin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404106-ACT

Il gene umano RCVRN codifica la recoverina, una proteina legante Ca2+ di tipo EF-hand arricchita nella retina, che funziona come interruttore Ca2+-miristoile per modulare la fototrasduzione. In risposta alle variazioni del Ca2+ intracellulare durante l’adattamento alla luce, la recoverina regola l’attività della chinasi della rodopsina (GRK1), modellando la dinamica di fosforilazione della rodopsina e le cinetiche di recupero nei fotorecettori a bastoncelli e a coni. Grazie al suo ruolo nella segnalazione dei GPCR, nell’omeostasi del Ca2+ e nella segnalazione visiva dipendente dal cGMP, la recoverina sostiene la normale trasduzione del segnale retinico e l’adattamento. Alterazioni dell’espressione o dell’immunoreattività della recoverina sono state associate a contesti di disfunzione retinica, rendendo RCVRN un bersaglio rilevante per studi meccanicistici sulla biologia dei fotorecettori e sulle reti di segnalazione visiva.

Recoverin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RCVRN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Recoverin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RCVRN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RCVRN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Recoverin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RCVRN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Recoverin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Recoverin nelle cellule tumorali con espressione di RCVRN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.