RBCK1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402044-ACT

RBCK1 (noto anche come HOIL-1) codifica una ligasi E3 dell’ubiquitina che funge da componente essenziale del complesso LUBAC, catalizzando l’ubiquitinazione Met1-linkata (lineare) per regolare le vie di segnalazione NF-κB e MAPK. Attraverso l’assemblaggio di catene lineari di ubiquitina su intermedi chiave della segnalazione, RBCK1 contribuisce a coordinare le risposte immunitarie innate, la segnalazione infiammatoria e le decisioni di sopravvivenza cellulare a valle di recettori come TNFR e i recettori di riconoscimento dei pattern. RBCK1 contribuisce inoltre alle vie di controllo qualità delle proteine e alla regolazione ubiquitina-dipendente di processi correlati all’autofagia. L’alterazione o la disregolazione dell’attività di RBCK1 è stata associata a fenotipi di immunodeficienza e autoinfiammazione, nonché a caratteristiche miopatiche e cardiomiopatiche, rendendolo rilevante per studi meccanicistici dell’omeostasi immunitaria e delle risposte allo stress.

RBCK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RBCK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RBCK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RBCK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RBCK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RBCK1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RBCK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RBCK1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RBCK1 nelle cellule tumorali con espressione di RBCK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.