RARα/Retinoic Acid Receptor α Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400529-ACT

RARA codifica RARα, un recettore nucleare attivato da ligando che eterodimerizza con gli RXR per legarsi agli elementi di risposta all’acido retinoico e regolare programmi trascrizionali che controllano le decisioni sul destino cellulare. Attraverso la segnalazione dei retinoidi, RARα modula lo stato della cromatina e le reti geniche che governano differenziamento, proliferazione e apoptosi, con forti collegamenti alla maturazione ematopoietica e allo sviluppo epiteliale. La sua attività si integra con vie trascrizionali ed epigenetiche fondamentali, inclusi lo scambio tra co-repressori e co-attivatori e il cross-talk con la segnalazione MAPK e PI3K. Un’espressione o una segnalazione di RARA deregolate sono associate a stati di differenziamento alterati e sono ampiamente studiate nella biologia dei tumori e in modelli di malattie dello sviluppo.

RARα/Retinoic Acid Receptor α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RARA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RARα/Retinoic Acid Receptor α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RARA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RARA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RARα/Retinoic Acid Receptor α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RARA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RARα/Retinoic Acid Receptor α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RARα/Retinoic Acid Receptor α nelle cellule tumorali con espressione di RARA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.