RANK Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423439-ACT

Il gene murino **Tnfrsf11a** codifica **RANK**, un membro della superfamiglia dei recettori del TNF che funge da trasduttore centrale del segnale per la comunicazione dipendente da RANKL tra i compartimenti immunitario, osseo e stromale. L’attivazione di RANK recluta adattatori TRAF per stimolare le vie di segnalazione **NF-κB**, **MAPK (ERK/JNK/p38)** e **PI3K–AKT**, coordinando la differenziazione e la sopravvivenza degli osteoclasti, nonché i programmi di espressione genica infiammatoria. In vivo e in vitro, un’alterata attività della via di RANK è strettamente associata a un rimodellamento osseo deregolato e a un crosstalk disfunzionale del microambiente immunitario, rendendo **Tnfrsf11a** un nodo chiave per lo studio dell’osteoimmunologia e dell’omeostasi tissutale. In quanto recettore con output dipendenti dal contesto, RANK offre un punto d’ingresso maneggevole per interrogare le reti trascrizionali a valle e i fenotipi cellulari guidati dal ligando.

RANK Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Tnfrsf11a senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RANK Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Tnfrsf11a nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Tnfrsf11a, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RANK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Tnfrsf11a nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RANK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RANK nelle cellule tumorali con espressione di Tnfrsf11a silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.