Raftlin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406009-ACT

RFTN1 codifica Raftlin, una proteina scaffold associata ai lipid raft ed espressa in modo arricchito nelle cellule immunitarie, dove contribuisce a organizzare microdomini di membrana che coordinano la segnalazione prossimale ai recettori. Raftlin partecipa alle vie del recettore delle cellule B e di altri immunorecettori regolando la localizzazione e la stabilità dei complessi di segnalazione all’interno di raft ricchi di colesterolo, influenzando i programmi trascrizionali a valle legati a MAPK e NF-κB. Per questi ruoli, RFTN1 viene studiato nel contesto dell’attivazione immunitaria, della dinamica della segnalazione dei recettori per l’antigene e della regolazione delle reti infiammatorie, con associazioni riportate a fenotipi di malattie immuno-mediate e ad alterazioni della funzione delle cellule immunitarie. La sua posizione prossimale alla membrana lo rende un nodo utile per analizzare come l’organizzazione dei raft plasmi la trasduzione del segnale e le risposte cellulari.

Raftlin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RFTN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Raftlin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RFTN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RFTN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Raftlin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RFTN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Raftlin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Raftlin nelle cellule tumorali con espressione di RFTN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.