Raf-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400202-ACT

RAF1 kodiert Raf-1, eine Serin/Threonin-Kinase, die als zentrale Relaisstation zwischen aktiviertem RAS und der MAPK-Kaskade fungiert. Sie leitet Signale über MEK und ERK weiter, um Proliferation, Differenzierung und stressabhängige Transkription zu regulieren. Die Aktivität von Raf-1 wird durch Phosphorylierung, die Bindung an 14-3-3 sowie die subzelluläre Lokalisation gesteuert und integriert Signale von Rezeptor-Tyrosinkinasen und weiteren upstream-Eingängen. Über die kanonische MAPK-Signalgebung hinaus beeinflusst Raf-1 Apoptose und Zytoskelett-Dynamik über kinaseabhängige sowie Scaffold-Funktionen, die Programme des Zellüberlebens mitbestimmen. Eine fehlregulierte RAF1-Signalgebung und RAF1-Varianten stehen mit gestörter Wachstumskontrolle und Entwicklungsstörungen in Zusammenhang, weshalb RAF1 häufig im Fokus von Pathway-Mapping und mechanistischen Krankheitsmodellen steht.

Raf-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Raf-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Raf-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Raf-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Raf-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.