Raf-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400202-ACT

RAF1 codifica Raf-1, una chinasi serina/treonina che funge da snodo centrale tra RAS attivato e la cascata MAPK, propagando i segnali attraverso MEK ed ERK per regolare proliferazione, differenziamento e trascrizione in risposta allo stress. L’attività di Raf-1 è controllata da fosforilazione, legame con 14-3-3 e localizzazione subcellulare, integrando segnali provenienti dai recettori tirosin-chinasici e da altri input a monte. Oltre alla segnalazione MAPK canonica, Raf-1 modula l’apoptosi e la dinamica del citoscheletro tramite funzioni dipendenti dalla chinasi e funzioni di scaffold che influenzano i programmi di sopravvivenza cellulare. La deregolazione della segnalazione di RAF1 e le varianti di RAF1 sono associate ad alterazioni del controllo della crescita e a disturbi dello sviluppo, rendendolo un nodo di frequente interesse nella mappatura delle vie di segnalazione e nella modellizzazione meccanicistica delle malattie.

Raf-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Raf-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Raf-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Raf-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Raf-1 nelle cellule tumorali con espressione di RAF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.