Rad52 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401948-ACT

RAD52 umano codifica Rad52, un fattore di riparazione del DNA che promuove la ricombinazione omologa e l’annealing a singolo filamento per ripristinare l’integrità genomica dopo rotture a doppio filamento. Rad52 partecipa alla riparazione associata alla replicazione e al riavvio mediato dalla ricombinazione, coordinandosi con la resezione delle estremità del DNA e con processi dipendenti da RAD51 all’interno della più ampia risposta al danno del DNA. La sua attività influisce sulla stabilità cromosomica, sugli esiti della ricombinazione e sulla sensibilità cellulare allo stress genotossico. Alterazioni della funzione di RAD52 o una maggiore dipendenza da RAD52 sono state studiate nel contesto di fenotipi di instabilità genomica osservati in diversi contesti di riparazione associati al cancro e in modelli di ricombinazione omologa compromessa.

Rad52 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAD52 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rad52 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAD52 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAD52, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rad52. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAD52 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rad52 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rad52 nelle cellule tumorali con espressione di RAD52 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.