Rad21 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402348-ACT

RAD21 umano codifica Rad21, una subunità fondamentale del complesso cohesin, che media la coesione tra cromatidi fratelli, l’organizzazione della cromatina di ordine superiore e la comunicazione a lunga distanza tra enhancer e promotore. Attraverso i ruoli della cohesina nell’instaurazione della coesione in fase S e nella segregazione dei cromosomi in mitosi, Rad21 sostiene la stabilità del genoma e programmi trascrizionali coordinati. La funzione di RAD21 interseca le vie della risposta al danno al DNA e del controllo del ciclo cellulare, e la deregolazione dei componenti della cohesina è associata all’instabilità cromosomica e ad alterazioni dei pattern di espressione genica osservate in diversi contesti patologici. Di conseguenza, RAD21 è ampiamente studiato nei meccanismi di stress replicativo, formazione di loop cromatinici e regolazione trascrizionale nelle cellule umane.

Rad21 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAD21 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rad21 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAD21 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAD21, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rad21. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAD21 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rad21 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rad21 nelle cellule tumorali con espressione di RAD21 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.