Rac 1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422573-ACT

Rac1 codifica Rac1, una piccola GTPasi della famiglia Rho che alterna stati legati a GDP e a GTP per coordinare il rimodellamento del citoscheletro di actina, la formazione dei lamellipodi e la polarità cellulare. Nelle cellule di topo, RAC1 integra segnali provenienti da recettori tirosin-chinasici, integrine e recettori per chemochine per regolare vie che coinvolgono PAK, PI3K/AKT, MAPK e la nucleazione dell’actina dipendente da WAVE/ARP2/3. Questi processi influenzano la dinamica dell’adesione, il traffico vescicolare e la segnalazione mediata da specie reattive dell’ossigeno attraverso complessi della NADPH ossidasi. Un’attività di RAC1 deregolata è stata associata a fenotipi di migrazione e invasione alterati, a segnalazioni di sviluppo aberranti e alla biologia tumorale, rendendola un nodo chiave negli studi meccanicistici sul controllo del citoscheletro e sulla trasduzione del segnale.

Rac 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Rac1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rac 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Rac1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Rac1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rac 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Rac1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rac 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rac 1 nelle cellule tumorali con espressione di Rac1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.