Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab11-FIP5: sc-407779-ACT

RAB11FIP5 code Rab11-FIP5, une protéine interagissant avec la famille Rab11 qui agit comme effecteur dans le trafic des endosomes de recyclage dépendant de Rab11. Elle coordonne le tri des vésicules et les processus de recyclage membranaire qui influencent le renouvellement des récepteurs, l’endocytose et le transport polarisé, façonnant ainsi les réponses de signalisation à la membrane plasmique. Par ses rôles dans la dynamique endosomale et le recyclage des cargos, Rab11-FIP5 contribue à la régulation de la migration cellulaire, de l’adhésion et de l’organisation du cytosquelette. Des voies de recyclage dérégulées impliquant des effecteurs de Rab11 ont été associées à une signalisation altérée et à des phénotypes invasifs observés dans plusieurs modèles pertinents pour la maladie, ce qui appuie son intérêt pour l’étude de mécanismes dépendants du trafic.

Rab11-FIP5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB11FIP5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab11-FIP5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB11FIP5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB11FIP5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab11-FIP5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB11FIP5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab11-FIP5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab11-FIP5 dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB11FIP5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.