Rab GDI β Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404136-ACT

GDI2 codifica l’inibitore della dissociazione del GDP di Rab beta (Rab GDIβ), uno chaperone citosolico che si lega alle Rab GTPasi prenilate e ne controlla l’estrazione dalle membrane, il riciclo e il trasporto dal citosol alla membrana. Regolando i cicli di attivazione delle Rab, Rab GDIβ sostiene le vie di traffico vescicolare essenziali per endocitosi, esocitosi e dinamica degli organelli, inclusi il trasporto Golgi ed endosomiale. Alterazioni dell’omeostasi delle Rab GTPasi e del controllo del traffico sono associate a deregolazione della segnalazione dei recettori, presentazione dell’antigene e adattamento metabolico, processi spesso implicati nella biologia del cancro e delle malattie neurodegenerative e infiammatorie. In quanto coordinatore centrale della localizzazione e della disponibilità delle Rab, GDI2 viene comunemente studiato per collegare difetti del traffico di membrana a cambiamenti a valle nella segnalazione e nel fenotipo cellulare.

Rab GDI β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GDI2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab GDI β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GDI2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GDI2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab GDI β. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GDI2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab GDI β nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab GDI β nelle cellule tumorali con espressione di GDI2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.