Rab 9A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416915-ACT

RAB9A codifica Rab 9A, una piccola GTPasi che regola la dinamica degli endosomi tardivi e il traffico retrogrado dagli endosomi tardivi alla rete trans-Golgi. Coordinando la gemmazione delle vescicole, il trasporto e la fusione di membrane, Rab 9A supporta lo smistamento endosomiale, l’omeostasi lisosomiale e il riciclo di carichi come i recettori del mannosio-6-fosfato. Questo asse di traffico interseca le vie autofagia–lisosoma e reti più ampie di traffico di membrana che modellano la proteostasi e la segnalazione cellulare. La disregolazione del trasporto endosomiale e dell’attività delle Rab GTPasi è stata collegata a meccanismi rilevanti per la neurodegenerazione, il traffico intracellulare dei patogeni e la biologia delle cellule tumorali, rendendo RAB9A un nodo utile per studi meccanicistici.

Rab 9A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB9A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 9A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB9A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB9A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 9A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB9A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 9A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 9A nelle cellule tumorali con espressione di RAB9A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.