Rab 9A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416915-ACT

RAB9A codifica a Rab9A, uma pequena GTPase que regula a dinâmica dos endossomos tardios e o tráfego retrógrado de endossomos tardios para a rede trans-Golgi. Ao coordenar o brotamento de vesículas, o transporte e a fusão de membranas, a Rab9A sustenta a triagem endossomal, a homeostase lisossomal e a reciclagem de cargas como os receptores de manose-6-fosfato. Esse eixo de tráfego interage com as vias de autofagia–lisossomo e com redes mais amplas de transporte de membranas que moldam a proteostase e a sinalização celulares. A desregulação do transporte endossomal e da atividade de GTPases Rab tem sido associada a mecanismos relevantes para a neurodegeneração, o tráfego intracelular de patógenos e a biologia de células cancerosas, tornando o RAB9A um nó útil para estudos mecanísticos.

Rab 9A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAB9A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rab 9A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAB9A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAB9A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rab 9A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAB9A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rab 9A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rab 9A em células tumorais com expressão de RAB9A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.