Rab 8A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404285-ACT

RAB8A codifica per la piccola GTPasi Rab8A, un regolatore centrale del traffico di membrana post-Golgi che coordina l’esocitosi polarizzata, la gemmazione delle vescicole e il tethering durante la consegna del carico alla membrana plasmatica e al ciglio primario. Rab8A agisce in sinergia con GEF ed effettori per controllare la dinamica degli endosomi di riciclo, la ciliogenesi e l’organizzazione del citoscheletro, influenzando così la polarità cellulare e la migrazione direzionata. Attraverso questi ruoli, RAB8A partecipa a vie collegate alla biologia delle ciliopatie e alla segnalazione dello sviluppo, e la sua disregolazione è stata associata a programmi secretori alterati e a comportamenti cellulari invasivi in contesti legati al cancro. Il traffico dipendente da Rab8A interagisce anche con il trasporto neuronale e con il rimodellamento di membrane associato all’autofagia, rendendolo rilevante per studi meccanicistici in tessuti diversi.

Rab 8A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB8A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 8A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB8A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB8A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 8A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB8A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 8A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 8A nelle cellule tumorali con espressione di RAB8A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.